Blog RSS Feed
Via E-mail
Twitter
Facebook
Elektroforesis
Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikel-partikel listrik. Elektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik (titik isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari molekul (Titrawani, 1996). Molekul terlarut dalam medan listrik bergerak atau migrasi dengan kecepatan yang ditentukan oleh rasio muatan dan massa. Sebagai contoh jika dua molekul mempunyai massa dan bentuk yang sama, molekul dengan muatan lebih besar akan bergerak lebih cepat ke elektrode. (David G. Watson, 2007). Bila arus listrik dialirkan pada suatu medium penyangga yang telah berisi protein plasma maka komponen-komponen protein tersebut akan mulai bermigrasi (Ricardson dkk. 1986).
Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan.
Dasar elektroforesis adalah pembentukan suatu ketidakhomogenan atau gradasi konsentrasi sepanjang sistem. Koloid, protein enzim menunjukkan mobilitas elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik yang dapat digunakan untuk identifikasi zat-zat spesifik. Pemisahan dapat dilakukan bila senyawa-senyawa yang telah terpisah tidak secara spontan bercampur kembali akibat sirkulasi konvektif. Pada elektroforesis, medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan.
Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode) (Klug & Cummings, 1994: A 6). Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatannya sehingga pergerakan molekul-molekul tersebut pada suatu fase diam (stationary phase) dalam sebuah medan listrik akan berbeda-beda. Oleh karena partikel sol bermuatan listrik, maka partikel ini akan bergerak dalam medan listrik. Kemampuan perpindahan pergerakan muatan molekul tersebut menuju ke arah kutub yang berlawanan merupakan suatu parameter kecepatan dalam proses elektroforesis yang dinyatakan sebagai mobilitas elektroforetik. Mobilitas elektroforetik merupakan laju perpindahan partikel bermuatan dalam cm per detik yang disebabkan karena pengaruh medan listrik 1 V per cm, dinyatakan dalam cm2V-1s-1. Mobilitas elektroforetik dapat ditetapkan hanya untuk elektrolit tertentu pada kondisi pengujian yang tepat.
Menurut Stenesh dalam Titrawani (1996) teknik elektroforesis dapat dibedakan menjadi dua cara, yaitu : elektroforesis larutan (moving boundary electrophoresis) dan elektroforesis daerah (zone electrophoresis). Pada teknik elektroforesis larutan, larutan penyangga yang mengandung makro-molekul ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan dialiri arus listrik. Kecepatan migrasi dari makro-molekul diukur dengan jalan melihat terjadinya pemisahan dari molekul (terlihat seperti pita) di dalam pelarut. Sedangkan teknik elektroforesis daerah adalah menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi sebagai media penunjang yang berisi (diberi) larutan penyangga. Media penunjang yang biasa dipakai adalah gel agarose, gel pati, gel poliakrilamida dan kertas sellulose poliasetat. Adapun menurut Sargent & George (1975) elektroforesis daerah disebut sebagai elektroforesis gel dengan dua buah model yaitu horizontal dan vertikal. Metode yang biasa digunakan adalah model horizontal, karena mempunyai beberapa keuntungan yaitu peralatan yang digunakan sangat sederhana, relatif murah dan pemisahan untuk enzim tertentu dapat menghasilkan pemisahan yang lebih baik.
Elektroforesis biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat bemigrasinya molekul-mulekul biologi. Media penyangganya bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan yang akan dianalisa. Media penyangga yang sering dipakai dalam elektroforesis antara lain yaitu kertas, selulose, asetat dan gel. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat.
Beberapa faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein yakni: (Soedarmadji, 1996)
1. Ukuran molekul protein
Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil.
2. Konsentrasi gel
Migrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi.
2. Bufer (penyangga) dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa protein yang bermuatan. Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik menjadi maksimal. Hal ini dapat mempercepat gerakan molekul protein. Kekuatan ion rendah dalam bufer akan menurunkan panas sehingga aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi molekul protein sangat lambat.
4. Medium penyangga
Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang bersifat relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai migrasi elektron atau penyaringan berdasarkan ukuran molekul seperti gel poliakrilamid (Sudarmadji, 1996).
· Jika ukuran pori dari medium kira-kira sama dengan molekul, maka molekul yang lebih kecil akan berpindah lebih bebas di dalam medan listrik, sedangkan molekul yang lebih besar akan dibatasi dalam migrasinya. Besarnya pori-pori dapat diatur dengan mengubah konsentrasi penyusun gel poliakrilamidnya yaitu akrilamid dan bisakrilamid.
5. Kekuatan voltase
· Voltase yang dipakai rendah (100-500) V, kecepatan migrasi molekul sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan.
· Voltase yang dipakai tinggi (500-10000) V, mobolitas molekul meningkat secara lebih tajam dan digunakan untuk memisahkan senyawa dengan BM rendah serta jenis arus yang dipakai selalu harus searah (bukan bolak balik).
6. Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung. Jika temperatur tinggi akan mempercepat proses bermigrasinya protein dan sebaliknya jika temperatur rendah akan mengurangi kekuatan bermigrasinya protein.
2.1.2. Elektroforesis gel
Elektroforesis gel digunakan untuk memisahkan atau melihat kemurnian DNA atau protein yang tidak bisa diperoleh dengan metode lain seperti gradient sentrifugasi. Media yang banyak dipakai dalam proses pemisahan ini adalah agarose atau akrilamid. Agarose digunakan untuk memisahkan molekul-molekul yang lebih besar karena memiliki ukuran partikel yang lebih besar. Sehingga daya pisah dari agarose (resolusi) lebih kasar (lebih lemah) dibandingkan akrilamid. Akrilamid memiliki ukuran partikel yang lebih halus sehingga daya pemisahannya lebih baik.
Elektroforesis melalui gel agarosa atau poliakrilamid merupakan Teknik ini merupakan teknik yang sederhana, cepat, dan dapat memisahkan molekul yang diinginkan dari matriksnya yang tidak dapat dilakukan oleh prosedur lainnya, seperti sentrifugasi gradient. (David G. Watson, 2007).
Jenis-jenis Elektroforesis Gel
a. Elektroforesis gel agarosa
Metode standar yang digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi dan memurnikan fragmen DNA adalah elektroforesis gel agorose. Teknik ini sederhana, cepat terbentuk, dan mampu memisahkan campuran potongan DNA sesuai dengan ukurannya secara akurat, dibanding dengan densitas gradient sentrifugasi. (Maniatis T. et al, 1982)
Agarosa yang disari dari ganggang laut merupakan polimer dengan dasar struktur D-alaktosa dan 3,6 –anhidro L-galaktosa. DNA dari 200 basa sampai 50 kilo basa dapat dipisahkan dengan gel agarosa dengan berbagai konsentrasi agarosa. Gel agarosa biasanya dilakukan dalam konfigurasi horizontal dalam kekuatan medan listrik dan arah tetap. (David G. Watson, 2007)
Gel agarosa dibuat dengan melelehkan agarosa dengan buffer dan kemudian dituangkan pada cetakan dan diamkan sampai dingin. Setelah mengeras, agarosa membentuk matriks dengan kerapatan yang ditentukan oleh konsentrasi agarosa. Jika medan magnet diberikan antara kedua ujung gel, DNA yang bermuatan negatif pada pH netral, bergerak ke anoda. Kecepatan migrasi ini ditentukan oleh ukuran (panjang) DNA, konformasi DNA, konsentrasi agarosa dan besaran tegangan yang digunakan. (David G. Watson, 2007)
Molekul DNA untai ganda linear, yanag diletakkan pada salah satu ujung gel, bergerak melalui matriks gel pada kecepatan yang berbanding terbalik terhadap log jumlah asam basa. Molekul yang lebih besar bergerak lebih lama karena terjadi gesekan lebih besar. (David G. Watson, 2007)
Hal ini disebabkan DNA harus melewati pori-pori gel sehingga kurang efisien lajunya daripada molekul yang lebih kecil.Fragmen DNA linear dengan panjang tertentu bermigrasi dengan kecepatan yang berbeda pada gel yang mengandung konsentrasi agarosa berbeda.
Cara yang paling mudah untuk mendeteksi adanya DNA dengan menggunakan etidium bromide, suatu senyawa berfluoresensi yang biasanya digunakan untuk mendeteksi DNA pada gel agarosa atau poliakrilamid. (David G. Watson, 2007)
b. Elektroforesis Gel Poliakrilamid
Akrilamid merupakan suatu monomer, yang jika ada radikal bebas, biasanya diberikan oleh ammonium persulfat dan distabilkan oleh TEMED, terjadi reaksi berantai sehingga monomer terpolimerisasi menjadi rantai panjang.
Gel poliakrilamid dibuat dengan cara menuangkan antar dua lempeng kaca yang dipisahkan dengan pembatas dengan ketebalan tertentu. Gel poliakrilamid berukuran dari 5 cm sampai 50 cm panjangnya tergantung pada keperluannya dan dilakukan elektroforesis dengan cara vertikal. (David G. Watson, 2007)
c. Elektroforesis Gel Poliakrilamid-SDS ( SDS-PAGE)
Protein dapat dipisahkan berdasarkan ukuran massanya dengan elektroforesis gel poliakrilamid dengan system gerak. Sebelumnya, campuran protein dipanasi dengan natrium dedosil suldat (SDS), suatu detergen anionik utnuk menyelubungi molekul protein. Penyelubungan ini menyebabkan interaksi nonkovalen terganggu sehingga molekul protein dalam struktur primer. Anion SDS berikatan dengan rantai utama dengan rasio satu molekul SDS untuk dua residu asam amino. . (David G. Watson, 2007)
Merkaptoetanol atau ditiotreitol juga ditambahkan untuk mereduksi ikatan disulfida. Kompleks SDS dengan protein terdenaturasi mempunyai jumlah muatan negatif yang sebanding dengan ukuran protein. Muatan negatif yuang terdapat pada ikatan SDS ini jauh lebih besar daripada muatan pada protein asli. Kompleks protein SDS kemudian dielektroforesis, sehingga semua molekul protein bergerak menuju kutub positif. Ketika elektroforesis selesai, protein dalam gel dapat ditampakkan oleh pewarnaan dengan perak atau zat warna seperti Coonassie biru, yang akan menampakkan beberapa pita. (David G. Watson, 2007).
2.1.3 DNA
Asam nukleat adalah polinukleotida yang terdiri dari unit-unit mononukleotida, jika unit-unit pembangunnya dioksinukleotida maka asam nukleat itu disebut dioksiribonukleat(DNA). DNA terutama ditemui dalam inti sel, asam ini merupakan pengemban kode genetik dan dapat memproduksi atau mereplikasi dirinya dengan tujuan membentuk sel-sel baru untuk memproduksi organisme itu dalam sebagian besar organisme, DNA suatu sel mengerahkan sintesis molekul RNA.
DNA merupakan rantai – rantai nukleutida yang secara kimia hampir tidak saling berbeda, sedangkan sebaliknya protein dari campuran 20 macam amino yang sangat berlainan, masing – masing dengan sifat kimianya yang khas. Keragaman inilah yang memungkinkan sifat kimia yang serba canggih dimiliki oleh setiap protein, dan ini diduga dapat menjelaskan mengapa evolusi telah memilih protein daripada molekul RNA sebagai katalisator yang terbesar reaksinya di dalam sel (Pratiwi, 2001). DNA dapat dipisahkan menggunakan agarose. Faktor-faktor yang mempengaruhi pergerakan DNA dalam gel adalah ukuran DNA, konsentrasi agarose, konformasi DNA, tegangan arus listrik yang digunakan, arah pergerakan medan listrik, susunan basa DNA dan suhu, adanya pewarnaan pada gel, dan komposisi bufer. Visualisasi (pewarnaan) pada hasil running elektroforesis dihasilkan dengan menggunakan EtBr (Ethidium Bromide). EtBr digunakan untuk mengurangi waktu yang diperlukan antara penyelesaian proses running dan pengamatan hasil. Metode yang paling cocok untuk visualisasi DNA dalam gel agarosa adalah staining dengan EtBr yang menghasilkan fluoresensi warna. EtBr dapat digunakan untuk mendeteksi adanya asam nukleat (DNA dan RNA) baik yang single maupun double strand ( Sambrook, et al, 1990).
DAFTAR PUSTAKA
Anonim a. 2009. Pengertian DNA dan RNA.
Available at :
Cited : 18 Desember 2010
David G. Watson. 2009. Analisis Farmasi. Jakarta : EGC
Khopkar, S. M., 1990, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI-Press, Jakarta
Klug, W. S. & M. R. Cummings. 1994. Concepts of genetics. 4th ed. Prentice Hall, Englewood cliffs: xvi + 779 hlm.
Pratiwi, R. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis.
Available at :
Cited : 18 Desember 2010
Sambrook, L., Fritsch, and Maniatis. 1990. Molecular Cloning. CSH. USA.
Skoog, A. D; F. J. Holler; and T. A. Nieman. 1998. Principle of Instrumental Analysis Fifth Edition. Saunders College Publishing
0 comments:
Post a Comment