Uji Kadar Bilirubin Total & Direk : Metode Jendrassik & Grof

 Uji Kadar Bilirubin Total &Direk : Metode Jendrassik & Grof

7.1              Tujuan

1. Untuk menentukan total bilirubin di dalam serum.

2. Untuk menentukan kadar direct bilirubin di dalam serum uji.

7.2              Metode yang Digunakan

Metode yang digunakan dalam penentuan kadar bilirubin baik bilirubin total atau bilirubin            direct yaitu Jendrassik & Grof.

7.3              Prinsip Pemeriksaan

Bilirubin adalah pigmen kuning yang berasal dari perombakan heme dari hemoglobin dalam proses pemecahan eritrosit oleh sel retikulo endotel. Disamping itu sekitar 20% bilirubin berasal dari perombakan zat-zat lain. Sel retikulo endotel membuat bilirudbin tidak larut dalam air; bilirubin yang disekresikan dalam darah harus diikatkan pada albumin untuk diangkut dalam plasma untuk menuju hati. Di dalam hati, sel hepatosit melepaskan ikatan itu dan mengkonjugasikannya dengan asam glukoronat sehingga bersifat larut air, dimana reaksi ini melibatka enzim glukoroni transferase (Joy ce, 2007).

Bilirubin terkonjugasi masuk ke saluran empedu dan dieksresikan ke usus. Selanjutnya flora usus akan mengubahnya menjadi urobilinogen dan dibuang melalui feses serta sebagian kecil dibuang melalui urine. Bilirubin yang terkonjugasi akan dengan cepat bereaksi dengan asam sulfanil yang terdiazotasi membentuk azobilirubin atau bilirubin langsung (direct bilirubin). Bilirubin terkonjugasi yang merupakan bilirubin bebas yang terikat albumin harus terlebih dahulu dicampur dengan alcohol, kafein, atau pelarut lain sebelum dapat bereaksi, dan sering disebut sebagai bilirubin tidak langsung (indirect bilirubin) (Joy ce, 2007).

Peningkatan kadar bilirubin direct menunjukan adanya gangguan pada hati berupa kerusakan pada sel hati atau kerusakan pada saluran empedu (batu atau tumor). Bilirubin terkonjugasi tidak dapat keluar dari empedu menuju usus sehinga akan masuk kembali dan terabsorbsi ke dalam aliran darah. Sedangkan peningkatan kadar bilirubin indirect sering dikaitkan dengan peningkatan destruksi eritrosit (hemolisis), seperti pada penyakit hemolitik oleh autoimun, transfuse, atau eritroblastosis fatalis. Peningkatan destruksi eritrosi tidak diimbangi dengan kecepatan konjugasi dan ekresi ke saluiran  empedu sehingga terjadi peningkatan kadar bilirubin indirect (Joy ce, 2007).

Peningkatan kadar bilirubin yang berlebih dapat disebabkan oleh beberapa faktor diantaranya yaitu :

1.      Hemolisis akibat inkompaktibilitas ABO atau isoimunisasi Rhesus, defisiensi G6PD, sferositosis herediter dan pengaruh obat.

2.      Infeksi, septicemia, sepsis, meningitis, infeksi saluran kemih, infeksi intrauterine.

3.      Polisitemia.

4.      Ekstravasasi sel darah merah, sefalhematom, kontusio, trauma lahir.

5.      Ibu diabetes.

6.      Asidosis.

7.      Hipoksia/asfiksia.

8.      Sumbatan traktus digestif yang mengakibatkan peningkatan sirkulasi enterohepatik.

Dalam uji laboratorium, bilirubin diperiksa sebagai bilirubin total dan bilirubin direct. Sedangkan bilirubin indirect diperhitungkan dari selisih antara bilirubin total dengan bilirubin direct. Metode pengukuran yang digunakan adalah fotometri atau spektrofotometri yang mengukur intensitas warna azobilirubin. Nilai rujukan :

DEWASA       : 

Total : 0,1±1,2 mg/dL

Direct : 0,1 ±0,3 mg/dL

Indirect : 0,1-1,0 mg/dL

ANAK :

Total : 0,2±0,8 mg/dL

 Indirect : sama dengan dewasa

BAYI BARU LAHIR :

Total : 1±12 mg/dL

Indirect : sama dengan dewasa

(Joy ce, 2007)

Bilirubin Total dan Direct

Peningkatan kadar dari bilirubin total dan direct dapat terjadi akibat ikterik obstruktif karena batu atau neoplasma empedu, hepatitis, sirosis hati, mononucleosis infeksiosa, metastasis hati, penyakit Wilson. Selain terjadi akibat penyakit dapat pula terjadi akibat penggunaan obat misalnya yaitu : antibiotik (amfoterisin B, klindamisin, eritromisin, gentamisin, linkomisin, oksasilin, tetrasiklin), sulfonamide, obat antituberkulosis (asam paraaminosalisilat, isoniazid), alupurinol, diuretic (asetazolamid, asametakrinat), mitramisis, dekstran, diazepam (valium), barbiturate, narkotik (kodein, morfin, meperidin), flurazepam, indometasin, metotreksat, metildopa, papaverin, prokainamid, steroid, kontrasepsi oral, torbutamid, serta vitaminA,C,K. sedangkan penurunan kadar dari bilirubin total dan direct dapat disebabkan karena anemia defisiensi besi dan pengaruh obat seperti barbiturate, salisilat (aspirin), penisilin, kafein dalam dosis tinggi (Joy ce, 2007).

Bilirubin Indirect

Peningkatan kadar dari bilirubin indirect dapat disebabkan oleh eritroblastosis fetalis, anemia sel sabit, reaksi tranfusi, malaria, anemia pernisiosa, septicemia, anemia hemolitik, talesemia,CHF, sirosis terdekompensasi, hepatitis, dan pengaruh obat seperti aspirin, rifampin dan fenotiazin. Sedangkan penurunan kadar bilirubin indirect disebabkan karena pengaruh obat (Joy ce, 2007).

Pemeriksaan bilirubin dalam urin berdasarkan reaksi antara garam diasonium dengan bilirubin dalam suasana asam, yang menimbulkan warna biru atau ungu tua. Garam diazonium terdiri dari p-nitrobenzene diazonium dan p-toluene sulfonate, sedangkan asam yang dipakai adalah asam sulfosalisilat. Adanya bilirubin 0,05-1 mg/dL urin akan memberikan hasil positif dan keadaan ini menunjukan kelainan fungsi hati atau saluran empedu. Hasil positif palsu dapat terjadi bila dalam urin terdapat mefenamic acid, chlorpromazine dengan kadar yang tinggi, sedangkan negatif palsu dapat terjadi bila urin mengandung metabolit pyidium atau serenium (Joy ce, 2007).

Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi temuan laboratorium :

1.      Makan malam yang mengandung lemak tinggi sebelum pemeriksaan dapat mempengaruhi kadar bilirubin.

2.      Hemolisis pada sampel darah dapat mempengaruhi hasil pemeriksaan.

3.      Sampel darah yang terpapar sinar matahari atau terang lampu, kandungan pigmen empedunya akan menurun.

4.      Obat-obatan tertentu dapat meningkatkan atau menurunkan kadar blirubin (Joy ce, 2007).

Metode pengukuran kadar bilirubin dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai macam metode yaitu :

1.      Van den Bergh, Malloy dan Reaksi Evelyn 

Metode ini digunakan reagen Ehlirch diazo, dimana reagen ini bila direaksikan dengan bilirubin direct dalam larutan berair akan membentuk kompleks senyawa berwarna merah muda sampai ungu dalam waktu 1 menit, sedangkan dalam larutan metil alcohol 50%, reagen Ehlirch diazo akan bereaksi dengan bilirubin total membentuk warna merah muda sampai ungu pada waktu penangguhan 30 menit (Anonim, tt).

2.      Jendrassik & Grof

Pada metode ini, serum atau plasma ditambahkan ke dalam larutan natrium asetat dan kefein-natrium benzoat. Natrium asetat berfungsi sebagai buffer pH pada reaksi diazo, sedangkan natrium benzoate-kafein berfungsi mempercepat kopling bilirubin dengan diazotized asam sulfanilic. Warna azobilirubin muncul dalam waktu 10 menit (Anonim, tt).

3.      ASTRA

Metode ini merupakan modifikasi dari metode Jendrassik & Grof (Anonim, tt).

4.      ACA

-          Untuk bilirubin terkonjugasi : bilirubin terkonjugasi bereaksi dengan DSA dalam suasana asam membentuk kromofor merah. Absorbansi kromofor sebanding dengan bilirubin terkonjugasi yang terdapat di dalam serum. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 540-600 nm.

Conjugated bilirubin + DSA + H+ 6 Red chromophore

(non-absorbing at 540 nm)     (absorbs at 540 nm)

(Anonim, tt).

-      Untuk bilirubin total : bilirubin total akan bereaksi dengan DSA dalam suasana asam membentuk kromofor berwarna merah. Lithium deodesil sulfat (OSZA) digunakan untuk melarutkan bilirubin tak terkonjugasi. Absorbansi kromofor berbanding lurus dengan bilirubin dalam sampel dan diukur dengan menggunakan panjang gelombang 540-600 nm.

(Anonim, tt).

Prinsip pemeriksaan dari uji kadar bilirubin ini adalah reaksi bilirubin dengan asam sulfanilic diazotized akan membentuk kompleks azobilirubin. Kompleks warna yang terbentuk sangat tergantung pada pH,  pada suasana asam atau netral akan terbentuk kompleks warna merah muda, sedangkan pada suasana basa akan terbentuk kompleks warna biru atau ungu.

                                                                                                                        (Anonim, tt)

7.4              Alat dan Bahan

a.      Alat

Tabung reaksi

Pipet ukur

Alat spektrofotometri

b.      Bahan

Aquades

Serum

Asam sulfanilat

Pereaksi diazo

Methanol

7.5              Cara Kerja

Penentuan Kadar Bilirubin Total dalam Serum :

Dibuat pereaksi diazo : 10 mL larutan asam sulfanilat dicampur dengan 0,3 mL Natrium Nitrit.

↓

Dicampur bahan uji dengan perbandingan sebagai berikut :

	Test (T)	Blanko (Bl)	Standar
Aquades (mL)	1	1	1
Serum/ plasma (mL)	0,1	0,1	0,1
Asam sulfanilat (mL)	-	0,3	0,1
Pereaksi diazo (mL)	0,3	-	0,3
Metanol (mL)	1,5	1,5	1,5

↓

Dicampurkan dan ditangguhan selama 30 menit.

↓

Dibaca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 530 nm dengan titik nol aquades.

↓

Digunakan standar 10 mg%, dibaca absorbansinya pada l 530 nm.

↓

Prosedur nomor 2 dilakukan sebanyak 2 kali.

Penentuan Direct Bilirubin

Dibuat pereaksi diazo : 10 mL larutan asam sulfanilat dicampur dengan 0,3 mL Natrium Nitrit.

↓

Dibuat campuran bahan uji dengan perbandingan sebagai berikut :

	Test (T)	Blanko (Bl)	Standar
Aquades (mL)	1	1	1
Serum / plasma (mL)	0,1	0,1	-
Asam sulfanilat (mL)	-	0,3	0,3
Pereaksi diazo (mL)	0,3	-	0,3
Metanol (mL)	-	-	0,1

↓

Dilakukan sebanyak dua kali prosedur di atas.

↓

Dicampur dan didiamkan selama 10 menit.

↓

Dibaca pada panjang gelombang 530 nm dengan titik nol aquades.

↓

Dicatat absorbansinya.

7.6              Hasil Pemeriksaan & Interpretasi Hasil

Hasil Pengamatan Kadar Bilirubin Total

Standar            = 0,015

Blanko A         = 0,020

Blanko B         = 0,033

Test A             = 0,042

Test B              = 0,017

Perhitungan :

Test A

Total bilirubin=

                       =

                       = 14,67 mg %

Test B

Total bilirubin =

                        =

                        = - 10,667 mg %

Perhitungan total bilirubin pada test B tidak dapat menunjukkan hasil karena menghasilkan nilai negatif.

Hasil Pengamatan Kadar Bilirubin Direct

Standar            = 0,001

Blanko A         = 0,014

Blanko B         = 0,025

Test A             = 0,034

Test B              = 0,080

Perhitungan  :

Test A

Total bilirubin =

                        =

                                    = 200 mg %

Test B

Total bilirubin  =

                       =

                                    = 550 mg %

Interpretasi Hasil

   Fraksi terkonjugasi (direct bilirubin) adalah fraksi yang larut dalam air sehingga dapat diekskresi oleh ginjal. Ketika dilakukan perhitungan dengan metode Van den Bergh, total serum bilirubin total konsentrasinya 17 mmol/L atau 1 mg/dL, lebih dari 80% dari bilirubin total atau 5,1 µmol/L (0,3 mg/dL) adalah nilai normal direct bilirubin (Harrison’s Principles of Internal Medicine 17^th Edition).

   Peningkatan konsentrasi bilirubin total plasma (unconjugated/indirect bilirubin) menunjukkan adanya peningkatan produksi bilirubin total plasma, penyakit hemolisis. Sedangkan peningkatan konsentrasi direct bilirubin menunjukkan kelainan hereditas, kerusakan sel-sel hati.

Pada hasil perhitungan bilirubin total dan direct bilirubin yang didapat saat praktikum, test A memiliki nilai total bilirubin > 0,1 mg/dL, yaitu 14, 67 mg/dL, dan untuk test B, yaitu -10,667 mg/dL. Untuk test A, nilainya jauh melebihi batas normal, maka dapat dikatakan terjadi hemolisis eritropoesis pada pasien A. Sedangkan untuk test B, hasil yang didapatkan memiliki nilai negatif (-10,667 mg/dL), sehingga tidak dapat diinterpretasikan. Perhitungan untuk direct bilirubin, nilainya pada test A = 200 mg/dL, dan pada test B = 550 mg/dL. Nilai ini sangat tinggi sehingga ada kemungkinan pada kedua pasien mengalami kelainan hereditas.

7.7              Pembahasan

Pada praktikum kali ini dilakukan penentuan kadar bilirubin total dan kadar bilirubin direct. Reaksi bilirubin dengan asam sulfanilic diazotized akan membentuk kompleks azobilirubin. Kompleks warna yang terbentuk sangat tergantung pada pH,  pada suasana asam atau netral akan terbentuk kompleks warna merah muda, sedangkan pada suasana basa akan terbentuk kompleks warna biru atau ungu.

                                                                                                            (Anonim,tt).

Bilirubin merupakan pigmen kuning yang berasal dari perombakan heme dari hemoglobin dalam proses pemecahan eritrosit oleh sel retikulo endotel. Sel retikulo endotel membuat bilirubin tidak larut dalam air; bilirubin yang disekresikan dalam darah harus diikatkan pada albumin untuk diangkut dalam plasma untuk menuju hati (Joyce,2007).

Dari hasil praktikum penentuan kadar total bilirubin dilakukan dengan menggunakan reagen diazo untuk membentuk kompleks warna yang nantinya dapat diukur dengan spektrofotometri. Penggunaan asam sulfanilat dalam reagen diazo ini berfungsi untuk memberikan suasana asam sehingga membantu pembentuk kompleks warna, sedangkan penambahan metil alcohol berfungsi untuk memberikan suasana basa, sehingga kompleks yang terbentuk akan berwarna merah muda sampai ungu.  Larutan ditangguhkan selama 30 menit bertujuan agar garam diazonium bereaksi sempurna dengan bilirubin yang terdapat dalam serum. Dari hasil pengamatan didapatkan bahwa, nilai absorbansi standar sebesar 0,015, blanko sebesar A 0,020 dan blanko B 0,033, dan absorbansi test A yaitu 0,042 test B yaitu 0,017 sehingga nilai total bilirubin A didapatkan sebesar 14,67 mg/dL, dan untuk test B sebesar -10,667 mg/dL, dimana nilai ini total  untuk dewasa yaitu : 0,1±1,2 mg/dL. Hasil negatif pada test B mungkin disebabkan oleh kesalahan pada saat pengerjaan, seperti pemipetan yang kurang akurat sehingga kadar total bilirubin yang rendah terbaca. Peningkatan nilai ini diakibatkan karena beberapa faktor misalnya yaitu:

1.      Hemolisis akibat inkompaktibilitas ABO atau isoimunisasi Rhesus, defisiensi G6PD, sferositosis herediter dan pengaruh obat.

2.      Infeksi, septicemia, sepsis, meningitis, infeksi saluran kemih, infeksi intrauterine.

3.      Polisitemia.

4.      Ekstravasasi sel darah merah, sefalhematom, kontusio, trauma lahir.

5.      Ibu diabetes.

6.      Asidosis.

7.      Hipoksia/asfiksia.

8.      Sumbatan traktus digestif yang mengakibatkan peningkatan sirkulasi enterohepatik.

Dari hasil praktikum penetuan kadar bilirubin direct juga dilakukan dengan menggunakan reagen diazo dalam suasana asam dengan menggunakan asam sulfanilat. Bilirubin dalam serum jika direaksikan dengan reagen diazo akan dapat membentuk kompleks warna yang nantinya diukur intensitasnya dengan spektofotometri. Pada pengukuran ini dilakukan penangguhan larutan selama 10 menit yang bertujuan agar bilirubin bereaksi dengan garam diazonium dengan bilirubin yang terdapat di di dalam serum. Dari hasil pengamatan didapatkan absorbansi standar 0,001, blanko A 0,014, blanko B 0,025, test A 0,034, dan test B 0,080.

Nilai rujukan untuk kadar bilirubin direct yaitu: 0,1 ±0,3 mg/dL. Dari hasil perhitungan, diperoleh nilai direct bilirubin yang sangat tinggi di atas normal, yaitu 200 mg/dL untuk test A dan 550 mg/dL untuk test B. Hasil ini dapat menunjukan keadaan kelainan fungsi hati atau saluran empedu. Hasil positif palsu dapat terjadi bila dalam urin terdapat mefenamic acid, chlorpromazine dengan kadar yang tinggi, sedangkan negatif palsu dapat terjadi bila urin mengandung metabolit pyidium atau serenium Peningkatan kadar bilirubin direct menunjukan adanya gangguan pada hati berupa kerusakan pada sel hati atau kerusakan pada saluran empedu (batu atau tumor). Bilirubin terkonjugasi tidak dapat keluar dari empedu menuju usus sehinga akan masuk kembali dan terabsorbsi ke dalam aliran darah (Joy ce,2007).

Selain dapat menentukan kadar bilirubin total dan bilirubin direct, juga dapat ditentukan kadar bilirubin indirect, kadar bilirubin indirect dapat ditentukan dengan selisih dari kadar total dengan kadar bilirubin direct.  Nilai rujukan untuk pengukuran kadar bilirubin indirect : 0,1-1,0 mg/dL. Peningkatan kadar bilirubin indirect sering dikaitkan dengan peningkatan destruksi eritrosit (hemolisis), seperti pada penyakit hemolitik oleh autoimun, transfuse, atau eritroblastosis fatalis. Peningkatan destruksi eritrosi tidak diimbangi dengan kecepatan konjugasi dan ekresi ke saluiran  empedu sehingga terjadi peningkatan kadar bilirubin indirect (Joy ce,2007).