Uji Kadar Glukosa Darah : Metode O-Toluidin

 Uji Kadar Glukosa Darah : MetodeO-Toluidin

9.1              Tujuan

Untuk menetapkan kadar glukosa dalam darah dengan cara O-Toluidin

9.2              Metode yang Digunakan

Metode O-Toluidin

9.3              Prinsip Pemeriksaan

Secara garis besar ada dua cara penetapan kadar glukosa darah dalam kimia klinik, yaitu cara kimiawi dan cara enzimatik. Metode yang paling banyak digunakan saat ini adalah metode enzimatik. Metode enzimatik dapat menggunakan beberapa enzim seperti enzim heksokinase, enzim glukosa oksidase, dan enzim glukosa dehidrogenase.

Metode O-Toluidin merupakan salah satu cara penetapan kadar glukosa darah secara kimiawi. O-Toluidin dapat bereaksi dengan glukosa dalam larutan asam asetat panas menghasilkan senyawa turunan berwarna (Burtis and Ashwood, 1994). Adapun prinsip reaksinya adalah sebagai berikut: kompleks kromosom (hijau kebiruan)

O-Toluidin berkondensasi dengan gugus aldehida glukosa membentuk glikosilamin dan basa Schiff. Penataulangan dan reaksi lebih lanjut menghasilkan senyawa berwarna hijau kebiruan dengan puncak serapan pada panjang gelombang 630 nm (Burtis and Ashwood, 1994)

Semakin tinggi intensitas cahaya yang diserap oleh alat maka semakin tinggi pula kandungan glukosa yang terdapat di dalam serum tersebut. Penentuan glukosa dengan O-toluidin dapat digunakan untuk bahan sampel yang dideproteinisasi maupun yang tidak dideproteinisasi.

9.4              Alat dan Bahan

a.      Alat

Tabung reaksi

Rak tabung reaksi

Pipet tetes

Pipet mikro

Pipet ukur

Gelas beaker

Spektrofotometer

b.      Bahan

Reagen Trichlor Asam Asetat (TCA)

Pereaksi O-Toluidin

Air suling

Standar Glukosa 100 mg%

Sampel serum

9.5              Cara Kerja

Disiapkan larutan standar, larutan test A, larutan test B dengan campuran sebagai berikut:

Bahan	Test A	Test B	Standar
TCA 5%, ml	1,00	1,00	1,00
Darah, ml	0,10	0,10	-
Standar, ml	-	-	0,10

↓

Bahan-bahan tersebut dicampur, lalu dipusingkan selama 5 menit dengan kecepatan 6000 rpm.

↓

Diambil supernatant test tersebut dan standar yang akan digunakan dalam pembuatan larutan campuran sebagai berikut:

Bahan	Test A	Test B	Standar	Blanko
Supernatan, ml	0,40	0,40	-	-
Supernatan standar, ml	-	-	0,40	-
Aquadest, ml	-	-	-	0,40
Pereaksi O-Toluidin, ml	2,00	2,00	2,00	2,00

↓

Bahan-bahan dicampur dan dimasukkan ke dalam penangas air berisi air mendidih selama 8 menit, lalu dimasukkan ke dalam air dingin.

↓

Campuran dibaca absorbasinya dengan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 625 nm-630 nm. Pengukuran dilakukan setelah larutan dingin.

Perhitungan:

mg% glukosa:

keterangan:

Dt                 : Hasil pembacaan pada test

Dst               : Hasil pembacaan pada standar

Nilai Normal: 65-115 mg%

9.6              Hasil Pemeriksaan & Interpretasi Hasil

Diketahui :

Dt A                = 1,540

Dt B                = 0,124

Dst                  = 0,168

Dblangko        = 0

Kadar standar = 100 mg%

Nilai normal    = 65-115 mg%

Ditanya :

            mg% glukosa test A = ?

            mg% glukosa test B = ?

Jawab :

            mg% glukosa =

            mg% glukosa test A    =

                                                = 916,67 mg%

            mg% glukosa test B    =

                                                = 73, 81 mg%

Interpretasi

Serum test A menunjukkan % kadar glukosa dalam darah sebesar 916,67 mg% dan pada serum test B sebesar 73, 81 mg%. nilai serum A melebihi nilai normal kadar glukosa serum, yaitu 65-115 mg%. Hasil ini menunjukkan bahwa pasien test A mengalami hiperglikemia. Pasien A belum tentu menderita Diabetes Mellitus sebab serum yang diambil tidak diketahui waktu pengambilannya, apakah saat pasien dipuasakan (gula darah puasa), saat sewaktu-waktu (gula darah acak), atau pada saat pasien dibebankan glukosa (GD). Salah satu ciri pasien DM adalah memiliki kadar gula darah acak (GDA) lebih dari 200 mg/dl, sedangkan nilai GDP lebih dari 126 mg/dl. Test B menunjukkan hasil kadar glukosa yang normal karena berada pada rentang nilai normal.

9.7              Pembahasan

Dilakukan penetapan kadar glukosa dalam serum darah dengan menggunakan metode O-Toluidine. Metode ini merupakan metode non enzimatis yaitu tidak menggunakan enzim melainkan hanya dengan menambahkan pereaksi O-Toluidine pada serum sampel yang telah dipreparasi sebelumnya dengan menambahkan larutan TCA (Tri kloro asetic acid) 5% dan didiamkan selama 10 menit. Penambahan larutan TCA 5% bertujuan untuk mengendapkan dan mendenaturasi protein yang terkandung dalam darah sampel. Selain itu juga dilakukan penambahan aquadest untuk mengencerkan konsentrasi dari sampel sehingga volumenya menjadi meningkat. Pencampuran dilakukan dengan cara membolak-balikkan tabung hingga terbentuk larutan homogen atau dapat pula digunakan alat vortex untuk homogenitas yang lebih sempurna. Larutan disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan 6000 rpm. Hal ini bertujuan untuk memisahkan glukosa dengan komponen protein dalam serum sehingga komponen protein akan mengendap sedangkan glukosa akan melarut dalam supernatan. Selanjutnya supernatan diambil dan ditambahkan dengan pereaksi O-Toluidin. Glukosa yang berada pada supernatan bereaksi dengan O-Toluidin dalam asam asetat panas dan menghasilkan senyawa berwarna hijau kebiruan. Penggunaan suhu tinggi bertujuan untuk meningkatkan energi kinetik reaksi yang terjadi. Setelah itu langsung dimasukkan ke dalam air dingin yang bertujuan untuk menghentikan reaksi. Setelah larutan dingin, dilakukan pembacaan absorbasi dengan alat spektrofotometer dan dilakukan perhitungan.

Dari perhitungan diperoleh nilai test A serbesar 916,67 mg%. Nilai ini melebihi nilai normalnya yaitu 65-115 mg%. Hasil ini menunjukan bahwa pasien test A mengalami hiperglikemia. Pada test B diperoleh nilai kadar glukosa sebesar 73,81 mg%. Nilai ini berada pada rentang nilai normalnya yaitu 65-115 mg%. Pasien test A yang memiliki kadar glukosa lebih tinggi dari normal belum tentu menderita Diabetes Melitus karena serum yang diambil tidak diketahui waktu pengambilannya apakah saat dipuasakan (Gula Darah Puasa), pada saat sewaktu-waktu (Gula Darah Acak), atau pada saat pasien diberikan beban glukosa (GD). Salah satu ciri pasien diabetes mellitus adalah memiliki GDA lebih dari 200 mg/dL, GDP lebih dari 125 mg/dL. Untuk lebih memastikan perlu diketahui waktu pengambilan sampel serum.