METODE PEMISAHAN

REVIEW JURNAL

Transformasi Fragmen DNA Kromosom Xanthomonas campestris Ke Dalam Escherichia coli

Penelitian transformasi fragmen DNA Xanthomonas campestris ke dalam Escherichia coli DH5αα, digunakan vektor plasmid Escherichia coli (pUC19). DNA kromosom diisolasi dengan metoda CTAB. DNA plasmid diisolasi dengan metoda alkali lisis. Kedua sumber DNA dipotong menggunakan enzim restriksi EcoRI. Sel kompeten disiapkan dengan CaCl2, transformasi menggunakan metoda kejutan panas.

Metode Penelitian

Pertumbuhan bakteri Xanthomonas campestris ditumbuhkan dalam Erlenmeyer 100 ml berisi 10 ml medium Luria Bertani (LB) yang mengandung 10 g tripton, 5 g yeast ekstrak, dan 10 g NaCl dalam 1000 ml H2O, ditambahkan antibiotik rifampicin (50 μμg/ml) pH 7,1-7,2.

Inokulum diambil dari koloni tunggal goresan kwadran pada medium YDC berisi 10 g yeast ekstrak, 5 g glukosa, 20 g CaCO3 dan 15 g agar/ 1000 ml akuades.pH 7,2, inkubasi selama 20 jam, dalam waterbath shaker 28oC, dengan pengocokan 125 rpm.

Isolasi DNA kromosom dilakukan dengan menumbuhkan biakan bakteri selama 20 jam, suspensi biakan dimasukkan ke dalam ependof 1,5 ml, disentrifugasi 5000 rpm, 2 kali. Pelet disuspensikan dengan 250 μμl bufer TE dan ditambahkan lisosim 5 μμg /ml, diinkubasi pada suhu 37oC selama 60 menit, sampai larutan menjadi bening. Campuran ditambahkan 50 μμl SDS 10% dan 5 ul Proteinase K (10 mg/ml) diinkubasi kembali pada suhu 37oC selama 60 menit, sampai campuran jadi kental. Campuran ditambahkan 65 μμl NaCl 5M dicampur dengan sempurna. Kemudian ditambahkan 80 μμl N-cetyl-N-N-N trimetil ammonium bromid (CTAB), diinkubasi pada suhu 65oC selama 20 menit. Penambahan kloroform: isoamil alkohol (24:1) dengan jumlah volume yang sama. Campuran digoyang pada pada shaker 150 rpm selama 30 menit, kemudian disentrifugasi selama 15 menit untuk mendapatkan supernatan yang berisi kromosom DNA. Supernatan yang membawa kromosom bagian fase atas dipindahkan ke ependof yang berisi 600 μμl isopropanol dingin. Tabung dibolak-balik sampai terbentuk benang-benang DNA. Benang DNA yang terbentuk disentrifugasi, dicuci dengan 700 μμl 70% etanol dingin. Endapan yang diperoleh merupakan DNA kromosom, dikeringkan dengan pompa vakum, dilarutkan dengan 40 μμl bufer TE. DNA terlarut disimpan dalam freezer, siap untuk digunakan.

Isolasi DNA plasmid dengan cara alkali lisis bakteri yang mengandung pUC19 setelah ditumbuhkan semalam dalam medium LB. Sebanyak 1,5 ml biakan dimasukkan tabung eppendof, disentrifugasi pada 5000 rpm selama 2 menit. Pelet yang diperoleh ditambahkan 110 μμl larutan glukosa EDTA, diinkubasi selama 10 menit. Selanjutnya ditambahkan larutan SDS-NaOH (4.25 ml H20 steril, 0,5 ml !0% SDS dan 0,25 ml 4N Na0H), divortek, inkubasi di atas es selama 10 menit. Ditambahkan larutan KAC/HAC dingin sebanyak 150 μμl, divortek diinkubasi di atas es selama 10 menit. Larutan disentrifugasi 5000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang diperoleh ditampung pada ependof yang baru, kemudian ditambah 0,5 ml fenol: kloroform:isoamil alkohol (25:24:1). Tabung dibolakbalik perlahan, disentrifugasi 5000 rpm selama 5 menit. Larutan yang berada di atas dipindahkan pada tabung ependof yang baru dan kemudian ditambahkan 1 ml etanol absolut dingin, campuran diinkubasi pada –20oC selama 10 menit, kemudian disentrifugasi 5 menit pada 5000 rpm. Pelet yang diperoleh dicuci dengan alkohol 70% dingin., alkohol dibuang dan pelet dikeringkan dengan pompa vakum selama 15 menit, terakhir pellet ditambahkan 20- 30 μμl TE buffer.

Ligasi dilakukan dengan menggunakan 1 unit/μμl enzim T4 ligase dan diinkubasi pada suhu 4oC selama 16 jam. Sel kompeten disiapkan dengan menginokulasi 10 ml LB medium dengan koloni tunggal Escherichia coli DH5αα diinkubasi pada suhu 37oC selama 16-20 jam.

Elektroforesis gel agarosa, dengan mengunakan 0,8% (b/v) dilarutkan dalam bufer TAE 1X. Sampel DNA plasmid/ kromosom yang akan dielektroforesis ditambahkan 1-2 μμl loading buffer. Elektroforesis dilakukan pada volume 35-45 volt, selama 2 jam. Visualisasi dilakukan dengan merendam agarose dalam EtBr (1μμl/ml) selama 5-10 menit. Pita DNA diamati dengan Uvi transluminator pada panjang gelombang 280 nm. Dokumentasi dengan fi lm instant polaroid type 667 Kodak.

HASIL

Transformasi fragmen DNA Xanthomonas campestris ke dalam Escherichia coli DH5αα, menggunakan vektor plasmid Escherichia coli (pUC19), menghasilkan 5 koloni putih, dengan frekuensi transformasi 1,22 X 10-8 koloni putih/sel kompeten, hasil elektroforesis agarosa menunjukkan variasi ukuran fragmen DNA, sebesar 0,5-7,5 kb.