Blog RSS Feed
Via E-mail
Twitter
Facebook
• Fitur membaca
Cahpter 4. Bagian B; Percobaan 6
• Sinopsis
enzim Immobilezed menjadi semakin penting dalam proses komersial. Dalam penelitian ini, siswa akan perangkap molekul dari horseradish peroksidase enzim dalam gel poliakrilamid matriks. Stabilitas reaksi kinetik dan termal dari enzim amobil akan diukur. Penelitian ini memperkenalkan pada siswa terhadap penggunaan enzim dalam bioteknologi.
I. Pendahuluan dan Teori
Prinsip-prinsip biotechnologi, aplikasi sel biologis atau komponen sel pada operasi teknis berguna, jarang intruduced untuk siswa dalam biologi hari ini, kimia, dan kelas biokimia. Dengan dampak meningkatnya biologi modern pada semua bidang ilmu pengetahuan dan industri, sangat penting bahwa siswa memiliki pemahaman operataions biothecnology og.
Yang digunakan enzim amobil dalam biothechnology menjadi luas dan mencakup beberapa daerah, termasuk industri kimia, menyebar dan mencakup beberapa daerah, termasuk industri kimia, farmasi, produksi makanan, obat, pengendalian lingkungan, kimia klinis, dan pertanian. aplikasi spesifik termasuk pembuatan anggur, cheesemaking, produksi alkohol untuk bahan bakar, pengolahan limbah, pertambangan logam, pengukuran glukosa dan constituens lain dalam cairan tubuh, dan penggantian enzim pada individu dengan gangguan genetik.
Enzim amobil
Enzim adalah reagen komersial berharga dan serbaguna untuk alasan-alasan berikut: (1) Mereka memiliki aktivitas katalitik yang tinggi, (2) mereka catalize berbagai macam reaksi, (3) Mereka memberikan reaksi forstereospecific potensial, (4) mereka fungsinya bawah umumnya ringan kondisi reaksi, dan (5) reaksi samping dan produk sekunder jarang terjadi. Namun, seiring dengan keunggulan sebagai katalis, enzim juga memiliki beberapa disavantages: (1) mereka umumnya hanya tersedia dalam jumlah kecil, (2) mereka yang rapuh, molekul tidak stabil, dan (3) mereka mahal dari sudut pandang komersial . Oleh karena itu, penggunaan komersial mereka dalam praktis hanya jika metode dapat ditemukan untuk meningkatkan stabilitas dan jika enzim dapat dipulihkan dan raused setelah proses yang diinginkan secara lengkap. Dengan kata lain, enzim yang digunakan dalam proses komersial harus didaur ulang. Salah satu metode terbaik untuk memastikan pemulihan aktif enzim imobilisasi molekul katalis. Imobilisasi dapat didefinisikan sebagai suatu proses yang membatasi difusi gerakan atau bebas dari molekul enzim dan biasanya melibatkan atachment enzim ke inert, air dukungan larut atau jebakan dalam microsphere matriks atau air-larut.
Selain pemulihan dan penggunaan kembali enzim amobil, ada beberapa keuntungan lainnya menggunakan mereka: (1) karena mereka berada dalam bentuk larut, mereka dapat dipisahkan dari campuran reaksi dan tidak mencemari produk; (2) amobil enzim ofen lebih stabil terhadap panas, perubahan pH, pelarut organik, dan kondisi reaksi yang merugikan dari enzim bebas; (3) mereka dapat digunakan secara terus menerus, misalnya, dalam reaktor aliran kolom, dan (4) titik akhir reaksi dapat dikontrol hanya dengan fisik memisahkan enzim dari solusi. enzim amobil juga menjadi penting dalam reseachr biohemical dasar. Banyak enzim dalam lingkungan alam mereka dalam organisme tidak bebas tetapi bergerak dalam sel, jaringan, dan membran. Bahkan enzim sitoplasma diadakan agak kaku dalam cystoskeleton matriks atau gelatin. Oleh karena itu, mempelajari karakteristik enzim amobil akan memberikan wawasan tambahan tentang bagaimana enzim funtionc dalam organisme hidup.
Metode immobilisasi
Empat metode telah dikembangkan untuk imobilisasi enzim: (1) adsorpsi fisik ke sebuah, inert dukungan larut, solid seperti kita sebagai polimer, (2) Chemical lampiran kovalen ke dukungan polimer larut (3) enkapsulasi dalam mocrosphere membarnous seperti. liposome, dan (4) jebakan dalam matriks gel. Pemilihan metode immobilisasi tergantung pada beberapa faktor, termasuk enzim yang digunakan, proses yang akan dilaksanakan, dan conditions.Trial reaksi dan kesalahan yang sering diperlukan untuk menemukan metode yang paling efektif. Dalam penelitian ini, enzim, horseradish peroksidase (donor: H2O2, oksidoreduktase; EC 1.11.1.7) akan dipenjara dalam matriks gel poliakrilamid. Metode jebakan telah dipilih karena cepat, murah, dan memungkinkan karakterisasi kinetik dari enzim amobil. peroxidase amobil atalyzes reaksi yang memiliki potensi komersial dan bunga, pembelahan reduktif peroksida hidrogen, H2O2, oleh donor elektron
Yang paling umum digunakan matriks untuk jeratan enzim adalah poliakrilamida cross-linked. Ketika akrilamida dan bisacrylamide metilen (agen cross-linking) diperbolehkan untuk polimerisasi, polimer cross-linked diproduksi (gambar E16.1). jika rasio yang tepat akrilamida dan bisacrylamide metilen digunakan untuk memperpanjang silang adalah sedemikian rupa sehingga molekul enzim ralatively besar dapat terperangkap dalam kandang polimer, sementara masih memungkinkan substrat yang relatif kecil dan molekul produk untuk meredakan mudah masuk dan keluar dari matriks. gel Akrilamida memiliki keuntungan lain di bahwa nonionik, karena itu, dibebankan molekul produk reactantand tidak ditahan di dalam gel. Untuk menghasilkan enyme terjebak, larutan enzim yang diinginkan dicampur dengan monomer akrilamida, cross-linking bisacrylamide agen metilen, dan katalis ditambahkan untuk inisiasi polimer. Dalam beberapa menit, massa gel padat dihasilkan, yang dicuci untuk menghilangkan enzim bebas yang belum terjebak. Gel yang mengandung enzim terperangkap sekarang siap untuk investigasi lebih lanjut dan analisis
Karakteristik Enzim amobil
Sebelum enzim amobil dapat digunakan untuk proses indrustrial, adalah penting untuk menggambarkannya dalam hal sifat katalitik dan kinetik. Sebuah uji quantittive harus dikembangkan untuk mengukur aktivitas, parameter kinetik, dan stabilitas enzim. Dalam reaksi kopling, H202 cepat bereaksi dengan fenol dan 4-aminoantipyrine (donor elektron) di hadapan peroksidase menghasilkan chromogen quinoneimine (Persamaan E16.2, Gambar E14.2), yang sangat diwarnai dengan serapan maksimum pada 510nm. (Ini adalah sama dengan produk yang terbentuk dalam analisis kolesterol dalam percobaan 14.)
Euation E16.2
H202 + fenol + quinoneimine peroksidase 4-aminoantipyrine à + 2H2O
Jumlah ini peroksidase akan mempengaruhi jumlah produk quinoneimine terbentuk. Bahkan, ada hubungan langsung dan linear antara jumlah yang hadir peroksidase dalam gel atau solusi dan intensitas warna yang dihasilkan. Intensitas warna atau serapannya dapat diukur pada spektrofotometer. Oleh karena itu, uji ini dapat digunakan untuk mengukur laju reaksi enzim-dikatalisis, yang memungkinkan perhitungan konstanta kinetik penting termasuk jumlah unit aktivitas enzim (U), contant Michaelis (Km), dan kecepatan maksimum (Vmax) . Enzim didukung dalam matriks mungkin tidak memiliki kinetis dengan cara yang sama sebagai salah satu solusi gratis. Ada beberapa alasan untuk hal ini: (1) imobilisasi dapat memaksa molekul nzyme untuk diambil pada konformasi yang berbeda, (2) lingkungan mikro kimia sekitar enzim amobil mungkin berbeda, dan (3) laju reaksi mungkin lebih sangat dipengaruhi oleh difusi dari molekul substrat ke gel. Kestabilan enzim juga sering diubah pada imobilisasi. Karakteristik ini dapat ditingkatkan dalam beberapa kasus karena menstabilkan pengaruh lingkungan sekitarnya matriks atau mungkin akan menurun karena mikro denaturing di dalam gel. Sulit untuk memprediksi apakah nzyme e akan stabil pada imobilisasi, sehingga trial and error masih diperlukan untuk menemukan kondisi optimum. Dalam penelitian ini, Anda akan mengukur dan membandingkan stabilitas termal peroksidase bebas dan amobil.
Sekilas Percobaan yang
Beberapa karakteristik reaksi peroksidase terimobilisasi gel, termasuk aktivitas dan stabilitas termal, akan diuji dalam percobaan ini. Sebuah uji spektrofotometri untuk peroksidase Dalam diperkenalkan. sastra Laporan banyak tes meassurement aktivitas enzim peroksidase. Uji aminoantipyrine-fenol dipilih karena cepat, nyaman, dan akurat dan membutuhkan reagen kurang toksik dibandingkan alat tes lain
requitments Waktu untuk penelitian ini adalah:
Bagian A: Persiapan peroksidase amobil (45 menit)
Bagian B: Pengujian peroksidase amobil (1 jam)
Bagian C: stabilitas termal dari peroksidase amobil (1 jam)
II. Bahan dan Perlengkapan
Hati-hati
Fenol adalah racun kronis. Ini mungkin fatal jika dihirup, ditelan, atau diserap melalui kulit.
Pertolongan Pertama: dalam kasus kontak, mata atau kulit segera siram dengan jumlah berlebihan air selama minimal 15 menit. Jika dihirup, lepaskan ke udara segar.
Akrilamida dalam bentuk unpolymerized adalah neurotoxin iritasi kulit anda potensial. Pakailah sarung tangan dan masker putih menimbang serbuk kering. Jangan menghirup debu. Siapkan solusi akrilamida semua dalam tenda. Jangan pipet mulut setiap solusi yang digunakan untuk pembentukan gel.
Pertolongan pertama: dalam kasus kontak, segera siram dengan ammounts berlebihan air selama minimal 15 menit. Jika dihirup, removre ke udara segar
Diposal gel: Biarkan kering di udara dan membuang dalam wadah khusus yang disediakan oleh instruktur.
Kalium fosfat buffer, 0,2 M, pH 7,0
Topi sekrup kilau atau sejenis botol, 20 mL
Saham solusi untuk n gel: 100 mg akrilamida elektroforesis kelas dan 1,1 g bisacrylamide metilen dalam 100 mL 0,2 M, pH 7,0 buffer fosfat.
Solusi riboflavin, 10 mg/100 mL buffer fosfat (disiapkan segar baru sebelum digunakan)
Tangki nitrogen dimurnikan
Horseradish peroksidase, 0,1 mg / mL dalam H20 nglass-suling (150-200 unit / mg)
Spektrofotometer dan cuvettes
Klinis centrifuge
4-Aminoantipyrine-fenol solusi. Siapkan dengan melarutkan 810 mg fenol (Perhatian) dalam 40 mL air suling kaca dan menambahkan 25 mg 4 aminoantipyrine. Encer menjadi volume akhir 50 mL dengan air suling kaca.
Hidrogen peroksida, 0,0017 M dalam air. Siapkan dengan mencampur 1 mL H202 30% dengan 99 mL air suling kaca. Selanjutnya encer 1 mL larutan ini untuk 50 mL dengan 0,2 M buffer fosfat, pH 7,0 (mempersiapkan segar baru sebelum digunakan).
Syringe (5 mL) dengan sistem filter 0,8 u
Konstan - suhu air mandi, 60 C
Untuk tabung 2 (point 3 menit), tambahkan 2,5 mL larutan H2O2. Segera campuran, dan catatan waktu. Lembut dan terus menerus campuran campuran reaksi. Pada akhir tepat 3 menit, transfer campuran reaksi terhadap barel dari syrlnge dengan sistem filter. memaksa solusi melalui saringan ke dalam mangkuk yg dihiasi dgn ukiran kaca. Baca absorbansi campuran reaksi pada 510 nm dan mencatat di notebook Anda.
Dalam tabung 3 dan 4, 0,1 g peroksidase amobil akan digunakan. Tube 3 akan mewakili titik nol dan tabung 4 titik menit 3. Timbang dua sampel 0,1 g peroksidase amobil dan transfer ke tabung dan 4. Tambahkan 2,5 mL larutan aminoantipyrin-fenol ke setiap tube dan aduk rata. Mengukur aktivitas peroksidase dalam tabung masing-masing dengan menambahkan 2,5 ml larutan H2O2 seperti sebelumnya; tabung 3 akan diperlakukan seperti tabung 1 dan tabung 4 seperti tabung 2. Baca dan merekam A 510 untuk tabung 3 dan 4. Ulangi prosedur dengan tabung 5 (titik nol) dan 6 (3 butir menit), masing-masing 0,2 g mengandung peroksidase amobil.
C. STABILITAS TERMAL PEROKSIDASE DIIMOBILISASIKAN
Pada bagian ini, stabilitas termal gel akrilamida amobil peroksidase akan dibandingkan dengan enzim bebas. Enzim bebas diuji dengan cara berikut: Encerkan 1 mL horseradish peroksidase saham (0,1 mg / ml, 15 unit / ml) dengan 299 ml air suling kaca. Tambahkan 1,0 ml enzim ini diencerkan untuk masing-masing dua tabung reaksi. Tempatkan salah satu tabung dalam penangas air 60 C selama tepat 4 menit. Biarkan tabung lain untuk duduk pada suhu kamar untuk interval waktu yang sama. Cool tabung suhu tinggi ke suhu ruang dengan menempatkan dalam bak air. Untuk setiap tabung menambahkan 2,0 ml larutan stok aminoantipyrin fenol dan 2,0 ml larutan H2O2 dan aduk rata. Biarkan tabung untuk duduk pada suhu ruang selama tepat 3 menit, kemudian immediatly membaca A 510 untuk masing-masing. Catat hasil pada notebook Anda.
Enzim amobil adalah diuji dengan cara sebagai berikut. Timbang dua sampel 0,1 g gel dan transfer ke dua tabung reaksi yang terpisah masing-masing berisi 0,5 ml buffer fosfat. Tempatkan salah satu tabung di bak mandi air 60 C dan biarkan yang lain untuk tetap pada suhu kamar. Pada akhir 4 menit, keluarkan tabung dari mandi, C 60 mendingin ke suhu ruang dalam bak air, dan tambahkan 2,25 ml larutan fenol aminoantipyrin dan 2,25 ml larutan H2O2. Perlahan campuran campuran reaksi untuk tepat 3 menit dan menghapus gel dengan melewatkan campuran melalui sistem jarum suntik-filter. membaca A ke tabung suhu kamar, abd 2,25 mL larutan fenol aminoantipyrin dan 2,25 ml H2O2. Lembut mix untuk tepat 3 menit dan terpisah gel dengan sistem filter jarum suntik. Baca A 510 dari campuran reaksi.
IV. ANALISIS HASIL
A. Pembuatan Peroksidase amobil
Jelaskan pengamatan Anda dari proses polimerisasi. Berapa gram gel akrilamida amobil peroksidase yang Anda mendapatkan?
B. Uji Dari Peroksidase amobil
Aktivitas peroksidase amobil dapat dihitung dari perubahan absorbansi untuk setiap campuran reaksi. Perubahan absorbansi dihitung sebagai berikut:
Xxxxxxxx rumus
Mana
Delta A = perubahan absorbansi keseluruhan
Sebuah min 3 absorbansi pada 510 nm = tabung 2,4, dan 6.
Sebuah min 0 absorbansi pada 510 nm = tabung 1,3 dan 5
Hitung delta A min / untuk masing-masing tiga set kondisi (0,05 g, 0,10 g, dan 0,2 g gel). Siapkan plot A delta / menit (sumbu y) vs mg gel (sumbu x). Menggambarkan dan menjelaskan bentuk grafik.
Gunakan persamaan di bawah ini untuk menghitung unit aktivitas per mg gel. Jumlah 6,58 di penyebut adalah penyerapan koefisien untuk produk uji chromogen quinoneimine.
Xxxxxxx rumus
Ulangi ini menghitung untuk ketiga jumlah gel (0,05,0,10,0,020 g) membandingkan hasil tiga.
C. Kestabilan Termal Peroksidase amobil
Tentukan laju reaksi untuk setiap kondisi reaksi empat. Asumsikan bahwa A min 0 = 0 untuk pengujian masing-masing.
A 1 = serapan berubah peroksidase gratis di suhu kamar
A2 = absorbansi perubahan untuk peroksidase gratis di 60 C
A3 = absorbansi perubahan untuk peroksidase amobil pada suhu kamar.
A4 = absorbansi perubahan untuk peroksidase bergerak di 60C
Hitung kegiatan% sisanya setelah pemanasan enzim bebas dan amobil:
Bandingkan dua hasil akhir. Mana yang lebih stabil terhadap panas, enzim amobil gratis atau?
Hitung aktivitas spesifik enzim bebas di unit / mg dengan menggunakan persamaan berikut:
Bandingkan angka ini dengan aktivitas spesifik yang diketahui dari enzim yang tercantum pada botol reagen.
Pertanyaan dan Masalah
1. Apa tujuan dari mencuci beberapa kali acrylmide gel dengan air seperti yang dijelaskan di bagian eksperimental, Sebagian? Bagaimana Anda eksperimental dapat menentukan saat mencuci selesai?
2. Desain percobaan menggunakan peroksidase amobil untuk menghitung konstanta Michaelis, Km dan kecepatan maksimum Vmax.
3. Bagaimana bisa Anda menentukan apakah gel adalah "bocor" peroksidase? Apa modifikasi eksperimental dapat dibuat untuk mencegah hal ini?
4. Apa yang harus menjadi bentuk sebidang A / menit (amobil aktivitas enzim) vs miligram gel? Jelaskan.
5. Apa tujuan dari riboflavin, amonium persulfat, dan sinar matahari pada percobaan ini?
Cahpter 4. Bagian B; Percobaan 6
• Sinopsis
enzim Immobilezed menjadi semakin penting dalam proses komersial. Dalam penelitian ini, siswa akan perangkap molekul dari horseradish peroksidase enzim dalam gel poliakrilamid matriks. Stabilitas reaksi kinetik dan termal dari enzim amobil akan diukur. Penelitian ini memperkenalkan pada siswa terhadap penggunaan enzim dalam bioteknologi.
I. Pendahuluan dan Teori
Prinsip-prinsip biotechnologi, aplikasi sel biologis atau komponen sel pada operasi teknis berguna, jarang intruduced untuk siswa dalam biologi hari ini, kimia, dan kelas biokimia. Dengan dampak meningkatnya biologi modern pada semua bidang ilmu pengetahuan dan industri, sangat penting bahwa siswa memiliki pemahaman operataions biothecnology og.
Yang digunakan enzim amobil dalam biothechnology menjadi luas dan mencakup beberapa daerah, termasuk industri kimia, menyebar dan mencakup beberapa daerah, termasuk industri kimia, farmasi, produksi makanan, obat, pengendalian lingkungan, kimia klinis, dan pertanian. aplikasi spesifik termasuk pembuatan anggur, cheesemaking, produksi alkohol untuk bahan bakar, pengolahan limbah, pertambangan logam, pengukuran glukosa dan constituens lain dalam cairan tubuh, dan penggantian enzim pada individu dengan gangguan genetik.
Enzim amobil
Enzim adalah reagen komersial berharga dan serbaguna untuk alasan-alasan berikut: (1) Mereka memiliki aktivitas katalitik yang tinggi, (2) mereka catalize berbagai macam reaksi, (3) Mereka memberikan reaksi forstereospecific potensial, (4) mereka fungsinya bawah umumnya ringan kondisi reaksi, dan (5) reaksi samping dan produk sekunder jarang terjadi. Namun, seiring dengan keunggulan sebagai katalis, enzim juga memiliki beberapa disavantages: (1) mereka umumnya hanya tersedia dalam jumlah kecil, (2) mereka yang rapuh, molekul tidak stabil, dan (3) mereka mahal dari sudut pandang komersial . Oleh karena itu, penggunaan komersial mereka dalam praktis hanya jika metode dapat ditemukan untuk meningkatkan stabilitas dan jika enzim dapat dipulihkan dan raused setelah proses yang diinginkan secara lengkap. Dengan kata lain, enzim yang digunakan dalam proses komersial harus didaur ulang. Salah satu metode terbaik untuk memastikan pemulihan aktif enzim imobilisasi molekul katalis. Imobilisasi dapat didefinisikan sebagai suatu proses yang membatasi difusi gerakan atau bebas dari molekul enzim dan biasanya melibatkan atachment enzim ke inert, air dukungan larut atau jebakan dalam microsphere matriks atau air-larut.
Selain pemulihan dan penggunaan kembali enzim amobil, ada beberapa keuntungan lainnya menggunakan mereka: (1) karena mereka berada dalam bentuk larut, mereka dapat dipisahkan dari campuran reaksi dan tidak mencemari produk; (2) amobil enzim ofen lebih stabil terhadap panas, perubahan pH, pelarut organik, dan kondisi reaksi yang merugikan dari enzim bebas; (3) mereka dapat digunakan secara terus menerus, misalnya, dalam reaktor aliran kolom, dan (4) titik akhir reaksi dapat dikontrol hanya dengan fisik memisahkan enzim dari solusi. enzim amobil juga menjadi penting dalam reseachr biohemical dasar. Banyak enzim dalam lingkungan alam mereka dalam organisme tidak bebas tetapi bergerak dalam sel, jaringan, dan membran. Bahkan enzim sitoplasma diadakan agak kaku dalam cystoskeleton matriks atau gelatin. Oleh karena itu, mempelajari karakteristik enzim amobil akan memberikan wawasan tambahan tentang bagaimana enzim funtionc dalam organisme hidup.
Metode immobilisasi
Empat metode telah dikembangkan untuk imobilisasi enzim: (1) adsorpsi fisik ke sebuah, inert dukungan larut, solid seperti kita sebagai polimer, (2) Chemical lampiran kovalen ke dukungan polimer larut (3) enkapsulasi dalam mocrosphere membarnous seperti. liposome, dan (4) jebakan dalam matriks gel. Pemilihan metode immobilisasi tergantung pada beberapa faktor, termasuk enzim yang digunakan, proses yang akan dilaksanakan, dan conditions.Trial reaksi dan kesalahan yang sering diperlukan untuk menemukan metode yang paling efektif. Dalam penelitian ini, enzim, horseradish peroksidase (donor: H2O2, oksidoreduktase; EC 1.11.1.7) akan dipenjara dalam matriks gel poliakrilamid. Metode jebakan telah dipilih karena cepat, murah, dan memungkinkan karakterisasi kinetik dari enzim amobil. peroxidase amobil atalyzes reaksi yang memiliki potensi komersial dan bunga, pembelahan reduktif peroksida hidrogen, H2O2, oleh donor elektron
Yang paling umum digunakan matriks untuk jeratan enzim adalah poliakrilamida cross-linked. Ketika akrilamida dan bisacrylamide metilen (agen cross-linking) diperbolehkan untuk polimerisasi, polimer cross-linked diproduksi (gambar E16.1). jika rasio yang tepat akrilamida dan bisacrylamide metilen digunakan untuk memperpanjang silang adalah sedemikian rupa sehingga molekul enzim ralatively besar dapat terperangkap dalam kandang polimer, sementara masih memungkinkan substrat yang relatif kecil dan molekul produk untuk meredakan mudah masuk dan keluar dari matriks. gel Akrilamida memiliki keuntungan lain di bahwa nonionik, karena itu, dibebankan molekul produk reactantand tidak ditahan di dalam gel. Untuk menghasilkan enyme terjebak, larutan enzim yang diinginkan dicampur dengan monomer akrilamida, cross-linking bisacrylamide agen metilen, dan katalis ditambahkan untuk inisiasi polimer. Dalam beberapa menit, massa gel padat dihasilkan, yang dicuci untuk menghilangkan enzim bebas yang belum terjebak. Gel yang mengandung enzim terperangkap sekarang siap untuk investigasi lebih lanjut dan analisis
Karakteristik Enzim amobil
Sebelum enzim amobil dapat digunakan untuk proses indrustrial, adalah penting untuk menggambarkannya dalam hal sifat katalitik dan kinetik. Sebuah uji quantittive harus dikembangkan untuk mengukur aktivitas, parameter kinetik, dan stabilitas enzim. Dalam reaksi kopling, H202 cepat bereaksi dengan fenol dan 4-aminoantipyrine (donor elektron) di hadapan peroksidase menghasilkan chromogen quinoneimine (Persamaan E16.2, Gambar E14.2), yang sangat diwarnai dengan serapan maksimum pada 510nm. (Ini adalah sama dengan produk yang terbentuk dalam analisis kolesterol dalam percobaan 14.)
Euation E16.2
H202 + fenol + quinoneimine peroksidase 4-aminoantipyrine à + 2H2O
Jumlah ini peroksidase akan mempengaruhi jumlah produk quinoneimine terbentuk. Bahkan, ada hubungan langsung dan linear antara jumlah yang hadir peroksidase dalam gel atau solusi dan intensitas warna yang dihasilkan. Intensitas warna atau serapannya dapat diukur pada spektrofotometer. Oleh karena itu, uji ini dapat digunakan untuk mengukur laju reaksi enzim-dikatalisis, yang memungkinkan perhitungan konstanta kinetik penting termasuk jumlah unit aktivitas enzim (U), contant Michaelis (Km), dan kecepatan maksimum (Vmax) . Enzim didukung dalam matriks mungkin tidak memiliki kinetis dengan cara yang sama sebagai salah satu solusi gratis. Ada beberapa alasan untuk hal ini: (1) imobilisasi dapat memaksa molekul nzyme untuk diambil pada konformasi yang berbeda, (2) lingkungan mikro kimia sekitar enzim amobil mungkin berbeda, dan (3) laju reaksi mungkin lebih sangat dipengaruhi oleh difusi dari molekul substrat ke gel. Kestabilan enzim juga sering diubah pada imobilisasi. Karakteristik ini dapat ditingkatkan dalam beberapa kasus karena menstabilkan pengaruh lingkungan sekitarnya matriks atau mungkin akan menurun karena mikro denaturing di dalam gel. Sulit untuk memprediksi apakah nzyme e akan stabil pada imobilisasi, sehingga trial and error masih diperlukan untuk menemukan kondisi optimum. Dalam penelitian ini, Anda akan mengukur dan membandingkan stabilitas termal peroksidase bebas dan amobil.
Sekilas Percobaan yang
Beberapa karakteristik reaksi peroksidase terimobilisasi gel, termasuk aktivitas dan stabilitas termal, akan diuji dalam percobaan ini. Sebuah uji spektrofotometri untuk peroksidase Dalam diperkenalkan. sastra Laporan banyak tes meassurement aktivitas enzim peroksidase. Uji aminoantipyrine-fenol dipilih karena cepat, nyaman, dan akurat dan membutuhkan reagen kurang toksik dibandingkan alat tes lain
requitments Waktu untuk penelitian ini adalah:
Bagian A: Persiapan peroksidase amobil (45 menit)
Bagian B: Pengujian peroksidase amobil (1 jam)
Bagian C: stabilitas termal dari peroksidase amobil (1 jam)
II. Bahan dan Perlengkapan
Hati-hati
Fenol adalah racun kronis. Ini mungkin fatal jika dihirup, ditelan, atau diserap melalui kulit.
Pertolongan Pertama: dalam kasus kontak, mata atau kulit segera siram dengan jumlah berlebihan air selama minimal 15 menit. Jika dihirup, lepaskan ke udara segar.
Akrilamida dalam bentuk unpolymerized adalah neurotoxin iritasi kulit anda potensial. Pakailah sarung tangan dan masker putih menimbang serbuk kering. Jangan menghirup debu. Siapkan solusi akrilamida semua dalam tenda. Jangan pipet mulut setiap solusi yang digunakan untuk pembentukan gel.
Pertolongan pertama: dalam kasus kontak, segera siram dengan ammounts berlebihan air selama minimal 15 menit. Jika dihirup, removre ke udara segar
Diposal gel: Biarkan kering di udara dan membuang dalam wadah khusus yang disediakan oleh instruktur.
Kalium fosfat buffer, 0,2 M, pH 7,0
Topi sekrup kilau atau sejenis botol, 20 mL
Saham solusi untuk n gel: 100 mg akrilamida elektroforesis kelas dan 1,1 g bisacrylamide metilen dalam 100 mL 0,2 M, pH 7,0 buffer fosfat.
Solusi riboflavin, 10 mg/100 mL buffer fosfat (disiapkan segar baru sebelum digunakan)
Tangki nitrogen dimurnikan
Horseradish peroksidase, 0,1 mg / mL dalam H20 nglass-suling (150-200 unit / mg)
Spektrofotometer dan cuvettes
Klinis centrifuge
4-Aminoantipyrine-fenol solusi. Siapkan dengan melarutkan 810 mg fenol (Perhatian) dalam 40 mL air suling kaca dan menambahkan 25 mg 4 aminoantipyrine. Encer menjadi volume akhir 50 mL dengan air suling kaca.
Hidrogen peroksida, 0,0017 M dalam air. Siapkan dengan mencampur 1 mL H202 30% dengan 99 mL air suling kaca. Selanjutnya encer 1 mL larutan ini untuk 50 mL dengan 0,2 M buffer fosfat, pH 7,0 (mempersiapkan segar baru sebelum digunakan).
Syringe (5 mL) dengan sistem filter 0,8 u
Konstan - suhu air mandi, 60 C
Untuk tabung 2 (point 3 menit), tambahkan 2,5 mL larutan H2O2. Segera campuran, dan catatan waktu. Lembut dan terus menerus campuran campuran reaksi. Pada akhir tepat 3 menit, transfer campuran reaksi terhadap barel dari syrlnge dengan sistem filter. memaksa solusi melalui saringan ke dalam mangkuk yg dihiasi dgn ukiran kaca. Baca absorbansi campuran reaksi pada 510 nm dan mencatat di notebook Anda.
Dalam tabung 3 dan 4, 0,1 g peroksidase amobil akan digunakan. Tube 3 akan mewakili titik nol dan tabung 4 titik menit 3. Timbang dua sampel 0,1 g peroksidase amobil dan transfer ke tabung dan 4. Tambahkan 2,5 mL larutan aminoantipyrin-fenol ke setiap tube dan aduk rata. Mengukur aktivitas peroksidase dalam tabung masing-masing dengan menambahkan 2,5 ml larutan H2O2 seperti sebelumnya; tabung 3 akan diperlakukan seperti tabung 1 dan tabung 4 seperti tabung 2. Baca dan merekam A 510 untuk tabung 3 dan 4. Ulangi prosedur dengan tabung 5 (titik nol) dan 6 (3 butir menit), masing-masing 0,2 g mengandung peroksidase amobil.
C. STABILITAS TERMAL PEROKSIDASE DIIMOBILISASIKAN
Pada bagian ini, stabilitas termal gel akrilamida amobil peroksidase akan dibandingkan dengan enzim bebas. Enzim bebas diuji dengan cara berikut: Encerkan 1 mL horseradish peroksidase saham (0,1 mg / ml, 15 unit / ml) dengan 299 ml air suling kaca. Tambahkan 1,0 ml enzim ini diencerkan untuk masing-masing dua tabung reaksi. Tempatkan salah satu tabung dalam penangas air 60 C selama tepat 4 menit. Biarkan tabung lain untuk duduk pada suhu kamar untuk interval waktu yang sama. Cool tabung suhu tinggi ke suhu ruang dengan menempatkan dalam bak air. Untuk setiap tabung menambahkan 2,0 ml larutan stok aminoantipyrin fenol dan 2,0 ml larutan H2O2 dan aduk rata. Biarkan tabung untuk duduk pada suhu ruang selama tepat 3 menit, kemudian immediatly membaca A 510 untuk masing-masing. Catat hasil pada notebook Anda.
Enzim amobil adalah diuji dengan cara sebagai berikut. Timbang dua sampel 0,1 g gel dan transfer ke dua tabung reaksi yang terpisah masing-masing berisi 0,5 ml buffer fosfat. Tempatkan salah satu tabung di bak mandi air 60 C dan biarkan yang lain untuk tetap pada suhu kamar. Pada akhir 4 menit, keluarkan tabung dari mandi, C 60 mendingin ke suhu ruang dalam bak air, dan tambahkan 2,25 ml larutan fenol aminoantipyrin dan 2,25 ml larutan H2O2. Perlahan campuran campuran reaksi untuk tepat 3 menit dan menghapus gel dengan melewatkan campuran melalui sistem jarum suntik-filter. membaca A ke tabung suhu kamar, abd 2,25 mL larutan fenol aminoantipyrin dan 2,25 ml H2O2. Lembut mix untuk tepat 3 menit dan terpisah gel dengan sistem filter jarum suntik. Baca A 510 dari campuran reaksi.
IV. ANALISIS HASIL
A. Pembuatan Peroksidase amobil
Jelaskan pengamatan Anda dari proses polimerisasi. Berapa gram gel akrilamida amobil peroksidase yang Anda mendapatkan?
B. Uji Dari Peroksidase amobil
Aktivitas peroksidase amobil dapat dihitung dari perubahan absorbansi untuk setiap campuran reaksi. Perubahan absorbansi dihitung sebagai berikut:
Xxxxxxxx rumus
Mana
Delta A = perubahan absorbansi keseluruhan
Sebuah min 3 absorbansi pada 510 nm = tabung 2,4, dan 6.
Sebuah min 0 absorbansi pada 510 nm = tabung 1,3 dan 5
Hitung delta A min / untuk masing-masing tiga set kondisi (0,05 g, 0,10 g, dan 0,2 g gel). Siapkan plot A delta / menit (sumbu y) vs mg gel (sumbu x). Menggambarkan dan menjelaskan bentuk grafik.
Gunakan persamaan di bawah ini untuk menghitung unit aktivitas per mg gel. Jumlah 6,58 di penyebut adalah penyerapan koefisien untuk produk uji chromogen quinoneimine.
Xxxxxxx rumus
Ulangi ini menghitung untuk ketiga jumlah gel (0,05,0,10,0,020 g) membandingkan hasil tiga.
C. Kestabilan Termal Peroksidase amobil
Tentukan laju reaksi untuk setiap kondisi reaksi empat. Asumsikan bahwa A min 0 = 0 untuk pengujian masing-masing.
A 1 = serapan berubah peroksidase gratis di suhu kamar
A2 = absorbansi perubahan untuk peroksidase gratis di 60 C
A3 = absorbansi perubahan untuk peroksidase amobil pada suhu kamar.
A4 = absorbansi perubahan untuk peroksidase bergerak di 60C
Hitung kegiatan% sisanya setelah pemanasan enzim bebas dan amobil:
Bandingkan dua hasil akhir. Mana yang lebih stabil terhadap panas, enzim amobil gratis atau?
Hitung aktivitas spesifik enzim bebas di unit / mg dengan menggunakan persamaan berikut:
Bandingkan angka ini dengan aktivitas spesifik yang diketahui dari enzim yang tercantum pada botol reagen.
Pertanyaan dan Masalah
1. Apa tujuan dari mencuci beberapa kali acrylmide gel dengan air seperti yang dijelaskan di bagian eksperimental, Sebagian? Bagaimana Anda eksperimental dapat menentukan saat mencuci selesai?
2. Desain percobaan menggunakan peroksidase amobil untuk menghitung konstanta Michaelis, Km dan kecepatan maksimum Vmax.
3. Bagaimana bisa Anda menentukan apakah gel adalah "bocor" peroksidase? Apa modifikasi eksperimental dapat dibuat untuk mencegah hal ini?
4. Apa yang harus menjadi bentuk sebidang A / menit (amobil aktivitas enzim) vs miligram gel? Jelaskan.
5. Apa tujuan dari riboflavin, amonium persulfat, dan sinar matahari pada percobaan ini?
0 comments:
Post a Comment