PEMERIKSAAN ALBUMIN DALAM SERUM DENGAN METODE BCG (Bromocerol Green)

I.                   Prinsip

Prinsip penetapan kadar gula darah dengan O-toluidin adalah berdasarkan pada pengendapan protein darah dengan asam trikloroasetat. Pada saat dipusingkan akan terlihat bagian yang mengendap, bagian tersebut adalah protein darah dan cairan yang ada di atas bagian yang mengendap mengandung gula yang akan diperiksa dengan menambahkan o-toluidin dalam asam asetat glasial, lalu dipanaskan. Saat dipanaskan, gula akan berkonjugasi dengan o-toluidin dalam asetat panas dengan memberikan warna biru kehijauan. Kemudian absorbansinya dapat diukur pada spektrofotometer UV-Vis untuk dihitung kadar glukosa dalam darah (Widowati dkk, 1997).

II.                Dasar Teori

Dalam ilmu kedokteran, gula darah adalah istilah yang mengacu kepada tingkat glukosa di dalam darah. Konsentrasi gula darah atau tingkat glukosa serum, diatur dengan ketat di dalam tubuh. Glukosa yang dialirkan melalui darah adalah sumber utama energi untuk sel-sel tubuh. Umumnya tingkat gula darah bertahan pada batas-batas yang sempit sepanjang hari: 4-8 mmol/l (70-150 mg/dl). Tingkat ini meningkat setelah makan dan biasanya berada pada level terendah pada pagi hari, sebelum orang makan (Anonim, 2011).

Normalnya kadar glukosa darah seimbang pada orang yang sehat melalui reaksi insulin dan glukagon yang dihasilkan oleh sel-sel pankreas (Lemon dan Burke, 2002). Apabila konsentrasi glukosa menurun, karena dikonsumsi untuk memenuhi kebutuhan energi tubuh, pankreas melepaskan glukagon, hormon yang menargetkan sel-sel di hati. Kemudian sel-sel ini mengubah glikogen menjadi glukosa (proses ini disebut glikogenolisis). Glukosa dilepaskan ke dalam aliran darah, hingga meningkatkan level gula darah. Sedangkan, apabila level gula darah meningkat karena perubahan glikogen atau karena pencernaan makanan, hormon yang lain dilepaskan dari butir-butir sel yang terdapat di dalam pankreas. Hormon ini, yang disebut insulin, menyebabkan hati mengubah lebih banyak glukosa menjadi glikogen. Proses ini disebut glikogenosis), yang mengurangi level gula darah (Anonim, 2011).

Ada tiga cara untuk mengukur tingkat gula darah:

1. Tes gula darah sewaktu.

Tes ini mengukur glukosa dalam darah yang diambil kapan saja, tanpa memperhatikan waktu makan.

2. Tes gula darah puasa.

Tes ini memakai contoh darah yang diambil saat perut kosong, setelah kita tidak makan atau minum apa pun (kecuali air putih) selama sedikitnya delapan jam.

3. Tes toleransi glukosa.

Tes ini dimulai dengan tes gula darah puasa. Kemudian kita diberikan minuman yang manis yang mengandung gula dengan ukuran tertentu. Tingkat gula darah lalu diukur dengan memakai beberapa contoh darah yang diambil pada jangka waktu yang tertentu.

            (Yayasan Spiritia, 2011)

Metode pengukuran gula darah lainnya yaitu:

a.       Metode enzimatik

Reaksi yang terjadi adalah :

Produk berwarna yang terbentuk akan diukur dengan metode kolorimetri (Anonim, 2010).

b.      Metode Kimia

·           Reaksi Oksidasi-Reduksi

Pada metode ini terjadi reduksi glukosa yang akan bereaksi dengan ion tembaga (Cu) pada media basa yang akan menghasilkan warna merah yang merupakan Cu₂O. Warna merah ini akan dapat diukur dengan alat kolorimeter atau dengan spektrofotometer.

Reaksi yang terjadi adalah :

·           Reaksi Kondensasi (Metode o-toluidine)

Pada metode ini, gugus amina aromatik, o-toluidin bereaksi dengan gugus aldehid terminal pada glukosa dalam asam asetat glasial panas membentuk wana biru kehijauan. Dengan pembentukan warna absorbansi dari larutan ini dapat dibaca. Panjang gelombang 630 nm merupakan panjang gelombang yang proporsional untuk mengukur absorbansi, sehingga kadar glukosa dapat dihitung. Metode ini cepat dan sederhana, namun reagen dapat bereaksi dengan aldosa (gula dengan gugus aldehid pada area terminal)

Reaksi yang terjadi :

(Anonim. 2010)

Pengukuran kadar gula darah dapat menentukan seseorang menderita diabetes atau tidak. Diabetes Mellitus adalah penyakit di mana tubuh gagal atau tidak bisa mengatur kadar gula di dalam darah (Insan, 2010). Menurut Tjokroprawiro (2000), Diabetes Mellitus ( DM) adalah penyakit metabolik yang kebanyakan herediter dengan tanda – tanda hiperglikemia dan glukosuria, disertai dengan atau tidak adanya gejala klinik akut ataupun kronik, sebagai akibat dari insufisiensi fungsi insulin dimana gangguan primer terletak pada metabolisme karbohidrat yang biasanya disertai juga gangguan metabolisme lemak dan protein. Insufisiensi fungsi insulin dapat disebabkan oleh gangguan atau defisiensi produksi insulin oleh sel-sel beta Langerhans kelenjar pankreas, atau disebabkan oleh kurang responsifnya sel-sel tubuh terhadap insulin.

III.             Alat dan Bahan

a. Alat

§  Tabung reaksi

§  Rak tabung reaksi

§  Pipet tetes

§  Pipet mikro

§  Sentrifugator

§  Spektrofotometer UV-Vis

b.  Bahan

§  Larutan Natrium Sulfit 25%

§  Serum/plasma

§  Ether

§  Pereaksi Biuret

§  Aquadest

IV.             Cara Kerja

1.    Disiapkan tabung reaksi yang telah diisi 2 mL larutan Natrium Sulfit 25%

2.    Ke dalam tabung tersebut dipipetkan 0,2 mL serum/plasma, 2 mL ether dan dicampur

3.    Tabung dipusingkan dengan sentrifugator

4.    Selanjutnya ether dan larutan protein (larutan bagian atas terdiri dari protein dan ether) dikeluarkan dengan penghisap

5.    Tabung dimiringkan lalu cairan bagian atas diambil dengan pipet mikro melalui dinding tabung.

6.    Larutan yang tersisa adalah larutan yang mengandung albumin (larutan ini yang kemudian akan dimasukkan ke dalam tabung reaksi tes).

7.    Disiapkan 3 tabung reaksi dan masing-masing diberi label larutan test, larutan standar dan blanko kemudian dimasukkan campuran seperti pada tabel di bawah ini:

	Tes	Standar	Blanko
Pereaksi Biuret, mL	1,0	1,0	1,0
Larutan albumin, mL	1,0	-	-
Standar, mL	-	1,0	-
Aquadest, mL	-	-	1,0

           

8.    Campuran tersebut ditangguhkan selama 14-30 menit, lalu dibaca dalam spektrofotometer pada panjang gelombang 540-546

9.    Rentang normal untuk kadar albumin dalam serum adalah 0,5-1,2 gram/dL

V.                Hasil

·         Absorbansi standar dari panjang gelombang 625-630 nm :

Tabung	Absorbansi
Standar	0,812
Tes (uji Ari Pramita)	0,156

·         Perhitungan :

Kadar albumin             =

=

= 0,7685 g%

VI.             Pembahasan

Pada praktikum ini dilakukan penetapan kadar glukosa di dalam darah. Penetapan kadar glukosa darah sangat penting peranannya di dalam kehidupan manusia karena dapat menentukan seseorang menderita diabetes mellitus atau tidak. Diabetes Mellitus (DM) adalah penyakit metabolik yang kebanyakan herediter dengan tanda–tanda hiperglikemia dan glukosuria, disertai dengan atau tidak adanya gejala klinik akut ataupun kronik, sebagai akibat dari insufisiensi fungsi insulin dimana gangguan primer terletak pada metabolisme karbohidrat yang biasanya disertai juga dengan gangguan metabolisme lemak dan protein. Insufisiensi fungsi insulin dapat disebabkan oleh gangguan atau defisiensi produksi insulin oleh sel-sel beta Langerhans kelenjar pankreas, atau disebabkan oleh kurang responsifnya sel-sel tubuh terhadap insulin (Tjokroprawiro, 2000).

Metode yang digunakan dalam penetapan kadar glukosa darah pada praktikum ini adalah metode pengukuran dengan menggunakan reagen o-toluidin. Metode  pengukuran dengan reagen o-toluidin merupakan salah satu metode pengukuran kadar glukosa dalam darah dimana prinsip pengukurannya berdasarkan pada pengendapan protein darah dengan asam trikloroasetat. Pada saat dipusingkan akan terlihat bagian yang mengendap, bagian tersebut adalah protein darah dan cairan yang ada di atas bagian yang mengendap mengandung gula yang akan diperiksa dengan menambahkan o-toluidin dalam asam asetat glasial, lalu dipanaskan. Saat dipanaskan, gula akan berkonjugasi dengan o-toluidin dalam asetat panas dengan memberikan warna biru kehijauan. Kemudian absorbansinya dapat diukur pada spektrofotometer UV-Vis untuk dihitung kadar glukosa dalam darah (Widowati dkk, 1997).

Praktikum ini diawali dengan penyiapan alat-alat dan bahan-bahan yang akan digunakan. Setelah semua alat dan bahan siap, kemudian dibuat campuran uji dan standar. Untuk campuran uji terdiri dari 0,10 mL darah uji dan 1,00 mL asam trikloroasetat 5% (T.C.A 5%), sedangkan untuk campuran standar terdiri dari 0,10 mL larutan standar dan 1,00 mL asam trikloroasetat 5% (T.C.A 5%). Penambahan asam trikloroasetat 5% (T.C.A 5%) bertujuan untuk mengendapkan protein darah sehingga supernatan hanya mengandung glukosa dan dapat ditetapkan kadar glukosa yang lebih tepat dari suatu larutan. Kedua campuran kemudian disentrifugasi selama 5 menit untuk memisahkan antara endapan yang mengandung protein darah dan supernatan yang mengandung glukosa. Supernatan dari kedua campuran diambil dan masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi untuk digunakan pada campuran selanjutnya. Setelah itu, dibuat larutan standar yang terdiri dari 0,40 mL supernatan standar dan 2,00 mL reagen o-toluidin. Dibuat pula larutan uji yang terdiri dari 0,40 mL supernatan uji dan 2,00 mL reagen o-toluidin serta larutan blanko yang terdiri dari 0,40 mL aquades dan 2,00 mL reagen o-toluidin. Selanjutnya, ketiga larutan dipanaskan dengan memasukkan masing-masing tabung reaksi ke dalam penangas air yang telah berisi air mendidih selama 8 menit. Pemanasan ini bertujuan untuk meningkatkan reaksi konjugasi antara glukosa dengan o-toluidin dalam asetat panas sehingga membentuk senyawa berwarna biru kehijauan. Berikut adalah reaksi antara o-toluidin dengan glukosa.

 Setelah terbentuk larutan yang berwarna biru kehijauan, masing-masing tabung reaksi dimasukkan ke dalam gelas beaker yang telah berisi air dingin. Pendinginan ini bertujuan untuk menghentikan reaksi konjugasi antara glukosa dan o-toluidin. Kemudian dilakukan pengukuran absorbansi dari masing-masing larutan dengan menggunakan alat spektrofotometer UV-Vis dimana pengukuran terlebih dahulu dilakukan terhadap larutan blanko yang bertujuan untuk mengkalibrasi alat, kemudian larutan standar dan yang terakhir larutan uji. Pengukuran absorbansi larutan dilakukan pada panjang gelombang maksimum, hal ini disebabkan karena pada λ maksimum sensitivitas alat menjadi maksimum sehingga perubahan absorbsi sampel per satuan konsentrasi adalah yang terbesar. Selain itu, pita absorbsi di sekitar panjang gelombang rata, sehingga kepekaaan analisis menjadi lebih baik dan pengaturan ulang panjang gelombang akan menghasilkan kesalahan analisis yang kecil (Gandjar dan Rohman, 2008). Panjang gelombang maksimum ditandai dengan nilai absorbansi larutan yang maksimum. Untuk mengetahui panjang gelombang maksimum maka terlebih dahulu dilakukan pengukuran absorbansi larutan standar pada rentang panjang gelombang 625-630 nm. Dari hasil pengukuran diketahui bahwa nilai absorbansi maksimal diperoleh pada panjang gelombang 630 nm, panjang gelombang ini yang kemudian digunakan untuk untuk mengukur absorbansi sampel berikutnya. Dari hasil pengukuran didapatkan absorbansi larutan standar adalah 0,368 dan absobansi larutan uji adalah 0,242. Untuk mendapatkan kadar glukosa darah pada sampel dilakukan perhitungan dengan menggunakan rumus :

mg% glukosa          =

Dari hasil perhitungan diperoleh kadar glukosa darah sampel sebesar 65,76 mg%. Hasil ini menunjukkan bahwa kadar gula darah pada sampel berada dalam keadaan normal dimana rentang normal kadar glukosa darah yaitu 65-115 mg%.

VII.          Kesimpulan

Kadar glukosa darah yang diuji berada dalam rentang normal (65-115 mg %).