PENETAPAN TOTAL PROTEIN SERUM DENGAN METODE BIURET

I.                   Prinsip

Prinsip penetapan kadar protein dalam serum dengan metode Biuret adalah pengukuran serapan cahaya kompleks berwarna ungu dari protein yang bereaksi dengan pereaksi biuret dimana, yang membentuk kompleks adalah protein dengan ion Cu²⁺ yang terdapat dalam pereaksi biuret dalam suasana basa. Semakin tinggi intensitas cahaya yang diserap oleh alat maka semakin tinggi pula kandungan protein yang terdapat di dalam serum tersebut.

II.                Dasar Teori

Protein berasal dari kata Yunani kuno proteos yang artinya “yang utama”. Dari asal kata ini dapat diambil kesimpulan bagaimana pentingnya protein dalam kehidupan. Protein terdapat pada semua sel hidup, kira-kira 50% dari berat keringnya dan berfungsi sebagai pembangun struktur, biokatalis, hormon, sumber energi, penyangga racun, pengatur pH, dan bakan sebagai pembawa sifat turunan dari generasi ke generasi (Girindra, 1993).

Protein merupakan polipeptida berbobot molekul tinggi. Protein sederhana hanya mengandung asam-asam amino. Protein kompleks mengandung bahan tambahan bukan asam amino, seperti derivat vitamin, lipid atau karbohidrat. Protein berperan pokok dalam fungsi sel. Analisis terhadap protein dan enzim darah tertentu digunakan secara luas untuk tujuan diagnostik (Harper, 1995).

Protein dapat ditetapkan kadarnya dengan metode biuret. Prinsip dari metode biuret ini adalah ikatan peptida dapat membentuk senyawa kompleks berwarna ungu dengan penambahan garam kupri dalam suasana basa (Carprette, 2005).

Reaksi biuret terdiri dari campuran protein dengan sodium hidroksida (berupa larutan) dan tembaga sulfat. Warna violet adalah hasil dari reaksi ini. Reaksi ini positif untuk 2 atau lebih ikatan peptida (Harrow, 1954).

Penyerapan cahaya oleh protein disebabkan oleh ikatan peptida residu ritosil, triptofonil, dan fenilalanin. Juga turut dipengaruhi oleh gugus-gugus non-protein yang mempunyai sifat menyerap cahaya. Penyerapan maksimum albumin serum manusia terlihat pada panjang gelombang kira-kira 230 nm (peptida) dan dengan puncak lebar pada 280 nm karena serapan residu-residu asam amino aromatik. Spektrum absorbansi suatu larutan protein berfariasi tergantung pada pH dan sesuai denagn ionisasi residu sama amino (Montgomery, 1993).

Kerugian dari metode ini adalah hasil penetapannya tidak murni menunjukkan kadar protein, melainkan bisa saja kadar senyawa yang mengandung benzena, gugus fenol, gugus sulfhidrin, ikut terbaca kadarnya. Selain itu, waktu penetapan yang dipergunakan juga lama, sehingga sering kali kurang effektif (Lehninger, 1982).

III.             Alat dan Bahan

a. Alat

§  Tabung reaksi

§  Rak tabung reaksi

§  Pipet tetes

§  Pipet mikro

§  Spektrofotometer UV-Vis

b.  Bahan

§  Standar protein

§  Serum

§  Pereaksi biuret

o   K-Na-Tartrat   0,18 M

o   CuSO_4­             0,012 M

o   NaOH             0,2 M

IV.             Cara Kerja

1.    Disiapkan 3 buah tabung reaksi di dalam rak tabung dengan masing-masing tabung diberi nama Test, Standar dan Blanko

2.    Disiapkan larutan test, standar dan blanko di dalam tabungnya masing-masing dengan campuran sebagai berikut:

	Tes	Standar	Blanko
Pereaksi Biuret, mL	2,50	2,50	2,50
Serum/plasma, mL	0,05	-	-
Standar, mL	-	0,05	-
Aquadest, mL	-	-	-

           

3.    Bahan-bahan di atas dicampur, lalu ditangguhkan selama 30 menit

4.    Campuran dibaca absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm.

V.                Hasil

·      Absorbansi standar dari panjang gelombang 625-630 nm :

Tabung	Absorbansi
Standar	0,373
Tes	0,544

·      Perhitungan :

Kadar Protein total =

                                =

                                                = 10,06 g%

VI.             Pembahasan

Pada percobaan kali ini dilakukan penetapan kadar protein dengan metode Biuret dengan menggunakan spektrofotometer. Dimana prinsip dari metode ini adalah pengukuran serapan cahaya kompleks berwarna ungu dari protein yang bereaksi dengan pereaksi biuret dimana, yang membentuk kompleks adalah protein dengan ion Cu²⁺ yang terdapat dalam pereaksi biuret dalam suasana basa. Semakin tinggi intensitas cahaya yang diserap oleh alat maka semakin tinggi pula kandungan protein yang terdapat di dalam serum tersebut.

Dalam pereaksi biuret terkandung 3 macam reagen yaitu reagen yang pertama adalah CuSO₄ dalam aquadest dimana reagen ini berfungsi sebagai penyedia ion Cu²⁺ yang nantinya akan membentuk kompleks dengan protein. Reagen yang kedua adalah K-Na-Tartrat yang berfungsi untuk mencegah terjadinya reduksi pada Cu²⁺ sehingga tidak mengendap. Reagen yang ketiga adalah NaOH dimana fungsinya adalah membuat suasana basa. Suasana basa akan membantu pembentukan Cu(OH)₂ yang nantinya akan menjadi Cu²⁺ dan 2OH^-.

Pada saat sampel dikocok, jangan sampai menimbulkan buih karena akan mempengaruhi pengukuran absorbansi. Dan setelah ditetesi pereaksi biuret, sampel didiamkan selama 30 menit. 30 menit ini merupakan operating time yaitu waktu yang dibutuhkan agar seluruh reaktan/protein bereaksi seluruhnya dengan reagen. Setelah 30 menit, maka sampel diukur absorbansinya dengan alat spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm. Panjang gelombang 540 nm merupakan panjang gelombang serapan maksimum untuk warna ungu. Reaksi yang terjadi pada penetapan kadar protein dengan metode Biuret adalah :

CuSO₄.5H₂O + 2NaOH                       Cu(OH)₂+Na₂SO₄+5H₂O

Cu(OH)₂                      Cu²⁺  +  2OH^-

                                   

Setelah dilakukan pengukuran terhadap standar dan tes didapatkan absorbansi larutan standar adalah 0,373 dan absorbansi larutan test adalah 0,544. Perhitungan kadar protein dalam serum dilakukan dengan menggunakan rumus :

Kadar Protein total =

Sehingga didapatkan hasil kadar protein dalam serum adalah 10,06 gr/dL. Kadar ini berada diatas kadar normal yaitu 7,2-8 gram/dL. Hal ini menunjukkan bahwa kemungkinan terdapat masalah pada organ hati karena sebagian besar protein dimetabolisme di hati.

VII.          Kesimpulan

Kadar total protein dalam serum berada di atas rentang normal (7,2-8 gram/dL).